ISOLASI dan PURIFIKASI SENYAWA KAFEIN DARI TEH HITAM

Di  daun teh yang segar terdapat senyawa-senyawa seperti sellulosa, tannin, katekin, enzim polipenol oksidase,  kafein, flavonoid pigmen dan sedikit klorofil. Tetapi setelah mengalami fermentasi senyawa-senyawa tersebut dapat berubah struktur dan komposisinya.  Pada proses fermentasi katekin bereaksi dengan enzim polifenol oksidase menjadi Theaflavin dan Thearubigin yang merupakan mayor pigmen pada the hitam (Sang, 2004). Pada proses fermentasi, protein teregradasi dan klorofil diubah menjadi pheophytin ( PK Mahanta & M Hazarika, 1985). Pada teh fermentasi kandungan kafein meningkat ( PK Mahanta, 1988). Teh Hitam mngandung lebih banyak kafein yaitu 42-72 mg/8ons daripada pada teh hijau yaitu 9-50 mg/8ons ( Astill,2001 ; McCusker, 2003). Kandungan kafein pada the hitam lebih tinggi daripada teh oolong, teh hijau, dan teh segar, namun kandungan Epigllokatekin 3-gallat pada teh hitam terendah daripada the yang lain (Lin, 2003). Karena kafein terdapat dalam teh hitam, dengan komposisi yang banyak, maka akan dilakukan isolasi kafein pada praktikum ini.

Untuk mengisolasi kofein dari teh hitam , mula – mula 25 mg serbuk teh hitam ditempatkan dalam soxhlet extractor kemudian dilakukan ekstraksi dengan menggunakan pelarut etanol selama tiga jam . Prinsip dari ektraksi adalah menarik suatu senyawa tertentu kedalam pelarut yang sesuai . Alasan digunakan etanol sebagai pelarut karena etanol sebagai pelarut universal, sehingga dapat melarutkan kafein. Hal itu dikarenakan kafein larut dalam etanol dengan perbandingan 1:130 (Clarke, 1986). Selain itu, etanol dapat mengawaaktifkan enzim yang dapat menguraikan asam nukleat, sehingga keberadaan kafein tetap terjaga dalam ekstrak tersebut ( Robinson, 1991 ). Pada dasarnya senyawa induk purina tidak terdapat secara bebas di alam tetapi terikat dalam bentuk asam nukleat . Walaupun ada beberapa diantaranya yang terdapat bebas di alam , tapi hal ini diduga karena proses peruraian dari asam nukeat ataupun karena senyawa murni dari alam . (Robinson, 1991 ) Kofein merupakan purina xanthin sehingga ada kemungkinan kofein terdapat dalam bentuk asam nukleat ataupun dalam bentuk basa bebas ( akibat dari proses hidrolisis asam nukleat ). Oleh karena itu digunakan pelarut etanol yang tidakmerusak asam nukleat sehingga nantinya kofein yang dapat diisolasi lebih banyak . Digunaknan cara soxhletasi untuk melakukan ekstraksi karena soxhletasi mempunyai kelebihan diantaranya : waktu untuk mengekstraksi lebih cepat , ekstraksinya lebih sempurna karena digunakan penyariannya secara kontinyu, Dibutuhkan pelarut yang sedikit, senyawa yang disari lebih banyak. Prinsip dari soxhletasi adalah perendaman bahan yang ekstraksinya melalui pengaliran ulang larutan perkolat secara kontinyu sehingga bahan yang diekstraksi tetap terendam cairan, Akhirnya dengan alat tersebut juga dapat dilakukan ekstraksi melalui aliran bahan pelarut melintasi bahan yang akan diekstraksi secara kontinyu ( Voigt, 1995). Kelemahan dari soxhletasi adalah tidak cocok untuk bahan yang labil terhadap panas . Kofein mempunyai titik lebur Antara 235-237,5 ˚ C , sehingga kofein dapat dikatakan relatif stabil terhadap panas (Farmakope Indonesia Edisi III , 1995 ). Oleh Karena alasan tersebut digunakan cara soxhletasi untuk mengekstraksinya .

Ekstrak yang diperoleh kemudian diletakkan dalam cawan porselein yang telah berisi 12,5 magnesium oksida dalam 75 ml air , kemudian diuapkan hingga kering dengan penangas air . Penambahan magnesium oksida dilakukan dengan tujuan untuk menjerap kofein dalam ekstrak dan untuk menghilangkan senyawa tanin . ( Robinson, 1991 ) Hal tersebut karena tanin cenderung membentuk kompleks dengan kofein sehingga akan mempersulit tahap isolasi kofein. Dengan penambahan Magnesium oksida, tannin akan berikatan dengan Mg dan berubah menjadi bentuk garam, sehingga kafein terlepas dalam keadaan basa bebas. Penguapan dilakukan dengan tujuan untuk menghilangkan sisa air dan etanol karena kofein agak sukar larut dalam etanol .

Tahapan selanjutnya mendidihkan residu dengan menggunakan air mendidih sebanyak tiga kali ( 125ml ; 62,5ml ; 62,5ml ) kemudian disaring selagi panas dengan menggunakan corong buchner . Tujuan mendidihkan dengan menggunakan air adalah untuk mendesorpsi kofein yang muda ( Bentuk nukleosida ) karena bentuk nukleosida mempunyai kelarutan yang baik dalam air  ( Raphael ikan ) . Selain itu kelarutan kafein dalam air mendidih cukup besar yaitu dengan perbandingan 1:1 ( Clarke,1986 )

Bentuk suspensi akibat pemberian magnesium oksida disaring selagi panas dengan menggunakan corong buchner sehingga didapat larutan . Selanjutnya kedalam larutan tersebut ditambahkan 12 ml asam sulfat 10 %, lalu diuapkan hingga 1/3 volume awalnya . Tujuan dari penambahan asam sulfat ini adalah untuk mengendapkan sisa magnesium oksida dan untuk mendenaturasi asam nukleat sehingga dapat mencegah pembentukan ikatan kembali antara kofein dengan asam nukleat. (Robinson, 1991). Larutan tersebut kemudian disaring untuk menghilangkan endapan yang terbentuk akibat penambahan asam sulfat .

Langkah berikutnya adalah mengekstraksi dengan menggunakan 7,5 ml kloroform sebanyak tiga kali dalam corong pisah . Digunakannya kloroform karena kofein mudah larut dalam kloroform ( Farmakope Indonesia Edisi III , 1995 ). Kelarutan kafein dalam klorofom yaitu dengan perbandingan 1:7 ( Clarke,1986 ).  Kloroform bersifat non polar, jadi kafein cenderung terlarut dalam kloroform, sedangkan senyawa xantin lain seperti teofilin dan teobromin terlarut  dalam fase air, karena senyawa-senyawa tersebut cenderung bersifat lebih polar daripada kafein. Jadi perlakuan ini bertujuan untuk memisahkan kafein dari derivat xanthin lain.

Kemudian ditambahkan sedikit NaOH 1 % ke dalam ekstrak tersebut yang diikuti penggojongan secara perlahan . Penambahan NaOH berfungsi untuk menghilangkan warna kuning pucat dari ekstrak tersebut dan memberikan suasana basa sehingga kofein mudah larut dalam kloroform . Warna kuning tersebut disebabkan karena pigmen theaflavin dan thearubigin pada teh hitam. Penggojogan dilakukan secara perlahan karena penggojogan yang terlalu kuat akan menyebabkan terjadinya emulsi pada ekstrak . Adanya emulsi akan menyebabkan proses pemisahan yang kurang sempurna. Emulsi juga disebabkan oleh adanya sisa senyawa polifenol yang belum hilang, dengan penambahan NAOH, senyawa fenol menjadi fenolik anion dan membentuk garam, sehingga terjadi surfaktan anionik. Surfaktan tersebut yang menyebabkan emulsi. Hasil dari pemisahan tersebut akan terbentuk dua fase yaitu fase air ( lapisan atas ) dan fase kloroform ( lapisan bawah ). Kofein terdapat dalam fase kloroform .

Kemudian kloroform diuapkan sehingga akan terbentuk serbuk putih berbentuk jarum mengkilat dan menggumpal. Purifikasi senyawa kafein cukup dengan kristalisasi. Kafein dapat menyublim pada suhu 180°C ( Clarke,1986) Untuk mendapatkan kristal kofein yang mentah cukup dengan mengkristalkan kembali serbuk tersebut dengan sedikit air panas . Kristal yang terbentuk dalam percobaan kali ini adalah kristal putih agak kekuningan, seharusnya didapatkan kristal putih mengkilap. Hal ini disebabkan terbentuknya emulsi pada penambahn NaOH, Sehingga NaOH tidak optimal dalam menghilangkan warna kuning pcat pada ekstrak kloroform tersebut. Total kristal kofein yang berhasil diisolasi adalah 156,8 m

Permasalahan:

Dalam isolasi kafein dikatakan bahwa kita perlu menambahkan asam sulfat dengan tujuan mendenaturasi asam nukleat sehingga dapat mencegah pembentukan ikatan kembali antara kofein dengan asam nukleat. Mengapa hal ini perlu dilakukan karena setahu saya, asam nukleat itu sendiri dapat terdenaturasi dalam suhu tinggi. Bukankah pada isolasi ini berkali-kali kita telah menambahkan air panas dengan suhu tinggi? Mengapa kita masih menggunakan asam sulfat untuk mendenaturasi asam nukleat?